單細胞測序技術為生物學的發展帶來了革命性的變化，目前應用廣泛的是10x Genomics為代表的高通量單細胞轉錄組，但由於其晶片通道大小和微流控原理的限制，該技術不適用於形狀不規則且直徑大於40 μm的細胞，及細胞量極少的樣本。相比之下，Smart-seq技術可以對單個細胞或少量細胞直接進行擴增建庫，無細胞類型限制且單個細胞獲取的基因數量更多，仍舊被廣泛應用於胚胎髮育、生殖、神經科學等領域，為這些領域的研究提供強大的技術支撐。
Smart-seq單細胞轉錄組技術流程
近日，西北農林科技大學蘇建民教授在Journal of Biological Chemistry (JBC)期刊上發表了題為Single-cell RNA-seq and single-cell bisulfite-sequencing reveal insights into yak preimplantation embryogenesis的研究文章。該研究利用單細胞轉錄組（Smart-seq）和單細胞甲基化測序（single cell bisulfite-sequencing）等方法探索了氂牛早期胚胎髮育的複雜調控機制，揭示了表觀遺傳重編程和轉錄調控網絡之間的動態關係，並繪製了調控胚胎基因組激活（EGA）階段的重要候選基因網絡。研究結果有助於進一步了解EGA事件，為氂牛改良畜群的擴大和種質資源的保護奠定基礎。
鸿运国际(中国)提供了Smart-seq單細胞轉錄組和單細胞BS-seq的建庫測序和分析服務。
文章簡介
胚胎着床前的發育是一個複雜的過程，伴隨着一系列關鍵的生物學事件。這些事件與合子基因組激活（ZGA）發生相協調。哺乳動物的ZGA過程依賴於由各種信號分子精確調控的網絡基因表達程序。正常的胚胎基因組激活（EGA）對於持續發育是必要的，而異常激活則導致胚胎髮育失敗。然而，在哺乳動物，特別是在氂牛的研究中，對早期胚胎髮育期間EGA的複雜調控機制了解甚少。
材料&方法
材料：體外培養的氂牛MII卵母細胞和五個發育階段（2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑葚胚、囊胚）樣本；每個時期5-8個細胞/胚胎，每個時期生物學重複3次
方法：Smart-seq和單細胞BS-seq
研究結果
氂牛早期胚胎不同發育階段的單細胞圖譜
首先，作者利用Smart-seq技術對體外培養的MII卵母細胞和五個發育階段的胚胎進行了轉錄組圖譜繪製。其中MII卵母細胞中表達的基因數量最少；在卵母細胞和桑葚胚階段的基因表達變化最大，可能發生了母源—合子的轉變。
早期胚胎髮育過程中基因表達變化
作者接着通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）確定了核心遺傳網絡。動態基因表達模式分析中，簇6的基因表達水平在2-細胞階段增加，並在桑葚胚階段減少，表明其中的PAX9、MXD1和WWOX等基因僅參與胚胎基因組激活。
在8-細胞期到桑葚胚期鑑定出了最多的差異表達基因（DEG），表明氂牛胚胎基因組在這一轉變過程中被激活，也是主要的EGA階段。GO、KEGG和GSEA的結果表明，母系轉錄物在MII卵母細胞至2-細胞期為EGA編程了表觀基因組。
通過跨物種轉錄組分析，鑑定出了保守的母系樞紐基因（UHRF1、PRC1、ASF1B、SIN3A和 LOC618599）以及保守的合子樞紐基因（HDAC1/2、DPPA2、HSPD1和MRTO4）。這些樞紐基因在早期胚胎髮育過程中充當「主調節器」。
早期胚胎髮育過程中甲基化特徵
作者通過單細胞BS-seq研究了DNA甲基化對早期胚胎髮育的影響。發現在2-細胞階段具有較高的甲基化水平，而到了4-細胞期，甲基化水平迅速下降，並在8-細胞期達到最低水平，隨着甲基化的再次發生，桑葚胚胎期的甲基化達到最高水平。
作者通過差異甲基化區（DMR）分析分別發現了79,375個（8細胞期到桑葚胚階段）、14,919個（2細胞到4細胞階段）、12,097個（4細胞到8細胞階段）與DMRs相關的DNA區域。在高甲基化區域中，USP7的一段4.2kb區域富含DMR。GO和KEGG的結果表明合子基因的轉錄激活，可能是由於DNA甲基化作用。
轉錄組和甲基化組動態變化的相關性
將Smart-seq和單細胞BS-seq數據進行聯合分析，發現在8-細胞階段高表達的DEG中，甲基化基因的比例更高。在桑葚期觀察到相反的趨勢。在4-細胞和8-細胞階段的DEG中，甲基化基因的比例更高。在不同發育階段，基因啟動子區域的變化趨勢相同，基因表達水平與其對應的DNA甲基化水平呈負相關。整體甲基化水平方面，基因表達水平與其對應的DNA甲基化呈正相關。2-細胞階段啟動子甲基化高於4-細胞階段，而桑葚胚啟動子甲基化低於8-細胞階段。並鑑定出可能與胚胎髮育相關的甲基化驅動基因：UHRF1、AURKA、PLK1、TOP2B、CENPF、NUSAP1和CDC25B。
HDAC1/2和USP7對氂牛胚胎髮育的影響
最後，結合實驗驗證，抑制HDAC1/2或USP7的功能可降低囊胚的發育率及質量。表明HDAC1/2和USP7對於氂牛的植入前胚胎髮育的重要性。
文章結論
作者通過Smart-seq和單細胞BS-seq分析，探討了氂牛早期胚胎髮育EGA階段，表觀遺傳重編程和轉錄調控網絡之間的動態關係，揭示了HDAC1/2和USP7等轉錄因子在早期發育階段的重要作用。
