二代16S，長期以來一直是微生物群落分析的首選方法（Woese & Fox, 1977），然而，由於其PE150的測序讀長，只能測16S rRNA基因的部分區域，如V3-V4區域，這對於某些具有高序列相似性的微生物群體，不能提供足夠的解像度來準確區分近緣物種（Caporaso et al., 2012）。
宏基因組測序提供了一種相對詳實分析環境樣品中所有基因的方法。儘管這種方法能夠提供關於功能多樣性的豐富信息，但其在物種水平的解像度仍然受測序長度限制，且數據分析複雜，計算成本較高（Quince et al., 2017）。
三代16S全長測序技術能夠揭示更為豐富的微生物群落結構，能夠更有效地檢測到低豐度的物種（Singer et al., 2016）。並且由於全長測序可提升物種解像度，有助於揭示微生物群落結構的細微差別（Johnson et al., 2019）。
之前由於HiFi數據利用率的問題，對三代16S進行高深度的測序成本非常高，所以大部分的情況下，只進行10,000條CCS或者5,000條CCS的測序深度，對於土壤等複雜樣品，很難實現稀釋曲線飽和，難以檢出低豐度物種。
圖1 16S可變區比較
高深度三代16S全長是一種基於PacBio Revio測序平台的微生物多樣性分析方法，可以對16S rRNA基因進行全長測序，從而實現更高的物種解像度和準確性。測序數據量高達50,000條CCS甚至100,000條CCS。與傳統的二代16S和二代宏基因組測序相比，高深度三代16S全長有以下優勢：
相同的測序深度，輕鬆實現低豐度物種檢測。
覆蓋16S rRNA基因的所有9個可變區，而二代16S只能測序部分可變區，導致物種注釋的不完整和不準確。
可以解決基因組內16S rRNA基因拷貝間的變異問題，而二代16S和二代宏基因組測序無法區分不同拷貝的序列，影響物種和菌株水平的鑑定。
三代16S全長測序技術的應用範疇極為廣泛，它不僅在基礎科研中發揮着重要作用，更在臨床診斷、環境監測、農業以及生物技術開發等多個領域中展示了其獨特的價值。
醫學研究領域
三代16S全長測序技術已被用於揭示人體微生物組與各類疾病之間的關係。例如，研究表明腸道微生物群落結構的微妙變化與腸道疾病、肥胖、甚至心理健康狀況都有着密切聯繫（Johnsonet al., 2019）。通過全長16S rRNA基因的準確鑑定，研究人員能夠更有效地識別出與特定疾病狀態相關的微生物群體，進而推動個性化醫療的發展。
圖2 腸道微生物與宿主關係（Zhang et al., 2022）
環境科學領域
三代16S全長測序技術在監測水質、土壤微生物多樣性以及生物降解過程中的微生物作用方面都有着巨大潛力（Singeret al., 2016）。在大豆根際微生物的研究中發現，PacBio測序的16S全長解像度更高，而且相對於16S V4區測序，16S全長測序不僅發現了澇害提高了與氮循環相關微生物的相對豐度，而且還發現澇害增加了與磷循環相關微生物的相對豐度(Yu et al., 2022)。
圖3 二代16S V4、二代loopseq測序16S全長和PacBio測序16S全長群落內物種相關性網絡圖(Yu et al., 2022)
農業領域
在農業領域，這項技術可以幫助農業生產者對土壤和植物微生物群落進行深入了解，從而開發出更有效的作物生長促進方法和病害控制策略。例如，分析根際微生物群落結構的變化，可以優化施肥策略，提高作物產量和質量。
生物技術開發
此外，在生物技術開發方面，三代16S全長測序技術的應用也在快速展開。利用這項技術，研究人員可以從自然界中發掘新的微生物資源，包括那些產生新型抗生素、酶或其他生物活性物質的微生物。這不僅有助於生物製藥行業的發展，也為環境的生物修復提供了新的策略。
總之，三代16S全長測序技術作為一項革命性的技術，其應用已經並將繼續深刻影響着科學研究和實際應用的各個領域。隨着未來研究的深入，這項技術有望帶來更多令人激動的發現，並進一步擴大其在各個領域中的應用範圍。
高深度16S目前有哪些限制？
Silva、greengene、NCBI等數據庫大小有限，對於種水平的注釋還有待完善；
實驗過程需要擴增，如果樣品包含酶抑制成分，則會導致擴增失敗；
引物有偏好性，且不可避免，目前對於常見細菌的擴增效果比較好，而古菌等特殊原核擴增尚待更多實驗驗證。
安諾提供什麼服務？
16S、ITS、18S全長測序服務；
數據量：平均50,000條CCS/樣品，最低40,000條CCS/樣品；
質檢結果30天質保期；
不定期分析思路分享；
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參考文獻
Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. Nature. 2012;489(7415): 215-221.
Johnson JS, Spakowicz DJ, Hong BY, et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Reviews Microbiology. 2019;17(11): 705-714.
Quince C, Walker AW, Simpson JT, et al. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis. Nature Biotechnology. 2017;35(9): 833-844.
Singer E, Wagner M, Woyke T. Capturing the genetic makeup of the active microbiome in situ. Nature Methods. 2016;13(9): 729-731.
Woese CR, Fox GE. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: The primary kingdoms. Nature. 1977;276(5688): 491-494.
Zhang, Chenguang, Liu, Huifeng, Sun, Lei, et al. 「 An overview of host-derived molecules that interact with gut microbiota.」 iMeta 2023. 2, e88.
Yu T, Cheng L, Liu Q, et al. Effects of Waterlogging on Soybean Rhizosphere Bacterial Community Using V4, LoopSeq, and PacBio 16S rRNA Sequence. Microbiol Spectr. 2022, Feb 23;10(1):e0201121
